标签：  依鲁替尼

Bruton酪氨酸激酶(Bruton Tyrosine Kinase,BTK)是B细胞受体信号通路(B Cell Receptor,BCR)的重要组成分子,介导B细胞的迁移、趋化、粘附,并促进B细胞恶性肿瘤的增殖、生存及耐药。依鲁替尼是BTK一种小分子抑制剂,并已被FDA批准应用于慢性淋巴细胞白血病的一线治疗和套细胞淋巴瘤的二线治疗。

本研究拟通过DLBCL细胞系和DLBCL患者原代细胞探讨依鲁替尼诱导DLBCL凋亡及克服DLBCL耐药的作用机制。

方法:1.用不同剂量的依鲁替尼分别处理DLBCL细胞后,MTS法测出细胞增殖抑制率,膜联蛋白V/碘化吡啶染色和流式细胞术检测和分析DLBCL细胞凋亡情况;DAPI染色法观察细胞核变化情况;蛋白质印迹法(Western blot)检测DLBCL细胞裂解产物中BCL-2等的水平。2.DLBCL细胞与MSC共培养后,显微镜下计数向MSC趋化迁移的DLBCL细胞数及与MSC粘附的DLBCL细胞数;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MSC分泌CXCL-12的情况;流式细胞术检测DLBCL细胞CXCR4蛋白的表达;用携带有CXCR4的慢病毒转染DLBCL细胞后,再与MSC共培养,米托蒽醌和/或依鲁替尼对共培养的DLBCL细胞进行处理,膜联蛋白V/碘化吡啶染色检测DLBCL细胞凋亡;3.在MethoCult甲基纤维素培养基上将DLBCL细胞与MSC共培养后,用依鲁替尼进行处理,倒置显微镜观察DLBCL细胞体外克隆形成;将DLBCL细胞和MSC共同注射于NOD/SCID模型小鼠皮下,腹腔注射依鲁替尼2.5mg/kg/天进行治疗,定期测量肿瘤生长情况。

结果:1.依鲁替尼处理DLBCL细胞后,细胞增殖受到抑制并出现凋亡,并随依鲁替尼剂量增加而增强,呈现剂量依赖性;细胞出现核浓缩、细胞皱缩的凋亡形态改变;促凋亡蛋白BAD、BAX等的表达上调和抗凋亡蛋白如BCL-2、BCL-CL、MCL1等的水平受到抑制,caspase-3活化水平增加,引起细胞内蛋白质水解的级联反应,PARP被裂解失去活力,BTK、AKT、ERK的表达水平下调,磷酸化活化被抑制,BCR信号通路被阻断。

2.MSC促进DLBCL细胞向MSC的迁移和粘附,依鲁替尼抑制DLBCL细胞向MSC的迁移和DLBCL细胞与MSC的粘附,并呈剂量依赖性;MSC上调DLBCL细胞CXCR4的表达,DLBCL细胞促进MSC CXCL12的分泌,依鲁替尼抑制DLBCL细胞促进的CXCL12的分泌和MSC上调的CXCR4的表达;病毒转染后,DLBCL细胞出现CXCR4过表达,与MSC共培养后,米托蒽醌诱导DLBCL细胞凋亡的比例降低,加入依鲁替尼后,共培养体系凋亡率上升,说明依鲁替尼克服MSC介导的耐药作用;

3.MSC促进DLBCL细胞的体外克隆形成和DLBCL细胞的体内增殖生长,依鲁替尼抑制共培养时DLBCL细胞的体外克隆形成(P<0.01)并抑制DLBCL细胞在体内的增殖生长(P<0.05)。

结论:依鲁替尼具有直接抗肿瘤作用,通过提高促凋亡蛋白BAD、BAX等的表达和抑制抗凋亡蛋白如BCL-2、BCL-CL、MCL1等的水平激活caspase-3,引起细胞内蛋白质水解的级联反应,裂解PARP,诱导DLBCL细胞凋亡。在肿瘤微环境MSC介导的DLBCL细胞耐药的机制中,CXCL12/CXCR4轴是关键的媒介,依鲁替尼抑制CXCL12、CXCR4的分泌和表达水平,从而抑制该功能轴,进而克服DLBCL细胞的耐药作用。

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