研究表明，BET抑制剂抑制BRD4 / GDF15和BRD4 / IL6 / STAT3 / GDF15途径，从而使黑色素瘤细胞系对舒尼替尼敏感。

“这些研究结果表明，BET抑制剂介导的GDF15抑制在增强黑色素瘤中的舒尼替尼敏感性中起着关键作用，表明BET抑制剂与黑色素瘤中的舒尼替尼协同作用，”主要研究作者，中国湖南长沙湘雅癌症免疫治疗临床研究中心的Furong Zeng及其同事在一篇数据论文中写道。

为了确定FDA批准的药物库中的哪些药物与黑色素瘤中的BET抑制剂协同作用，研究人员在体外药物组合测定中筛选了240种抗肿瘤药物与研究人员开发的BET抑制剂JQ1联合使用。舒尼替尼和CDK4/6抑制剂在A1和SK-MEL-375黑色素瘤细胞中均与JQ28具有高水平的协同作用。

为了进一步确定舒尼替尼和JQ1之间的协同作用，研究人员进行了一项剂量反应实验，增加了A375和SK-MEL-28细胞中的药物浓度。两种细胞系的组合指数值均小于1，表明药物协同作用。在舒尼替尼和NHWD-375之间也注意到A28和SK-MEL-870细胞的协同作用，NHWD-<>是研究人员开发的另一种BET抑制剂。

研究人员还进行了集落形成测定，以确定BET抑制剂加舒尼替尼的抗增殖作用，发现与这些药物的联合治疗显着抑制了黑色素瘤细胞的增殖，进一步支持了舒尼替尼和BET抑制剂之间协同作用的假设。

为了阐明这种协同作用是如何发生的，研究人员对用对照，JQ375单独，舒尼替尼单独或JQ24加舒尼替尼处理1小时的A1黑色素瘤细胞进行了RNA测序分析。基因集富集分析表明，与其他组相比，该组合对细胞周期进程的抑制作用更大。该组合抑制了17个细胞周期相关基因，包括调节细胞周期的CDK1和调节真核细胞中DNA复制的CDC6。此外，流式细胞术表明，BET抑制剂加舒尼替尼比BET抑制剂或单独使用舒尼替尼诱导G1停滞更多。

基因集变异分析表明，该组合比单独使用每种药物更能激活自噬和细胞凋亡途径。该组合的抗肿瘤作用被细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK部分抑制，但铁死亡，坏死性凋亡或自噬抑制剂不能抑制。Z-VAD-FMK还部分抑制了JQ375和不同浓度舒尼替尼诱导的A1细胞死亡。此外，BET抑制剂和舒尼替尼的组合与单独使用任何一种药物的凋亡细胞比例更高，表明该组合驱动黑色素瘤细胞的凋亡。

研究人员还分析了STAT3信号传导，部分细胞周期停滞和凋亡以及舒尼替尼敏感性之间的关联。发现STAT3信号在舒尼替尼半最大抑制浓度（IC50）较高的细胞中显着激活。此外，GSEA显示STAT3抗性细胞具有激活的IL6 / JAK / STAT3途径。STAT3磷酸化在产生的舒尼替尼耐药黑色素瘤细胞中也增加。在生成的STAT3敲低黑色素瘤细胞中，STAT3抑制增强了舒尼替尼的敏感性。此外，STAT3抑制剂使SK-MEL-28和A375细胞对舒尼替尼敏感。

在研究介导黑色素瘤细胞对舒尼替尼敏感性的STAT3磷酸化位点时，研究人员异位表达野生型STAT3或STAT3磷酸化突变体。他们发现野生型STAT3的共表达损害了shSTAT3诱导的黑色素瘤细胞致敏，但STAT3磷酸化突变体没有。这些发现表明，STAT3抑制通过STAT3磷酸化抑制增强了黑色素瘤细胞对舒尼替尼的敏感性。

研究人员进一步分析了BET抑制剂通过抑制STAT3信号传导使黑色素瘤细胞对舒尼替尼敏感的能力。在JQ1处理的细胞中，JQ1抑制c-Myc靶表达。然而，具有STAT3诱导下调的靶标在JQ1处理的细胞中上调，表明JQ1抑制IL6 / STAT3信号活性。用BET抑制剂处理的黑色素瘤细胞中的IL6浓度也降低，STAT3磷酸化也是如此。

为了确定哪些BET蛋白有助于IL6 / STAT3途径信号传导，研究人员单独沉默了BRD2，BRD3和BRD4，这表明只有BRD4蛋白敲低显着降低了IL6浓度和STAT3磷酸化。进一步的BRD4沉默抑制了STAT3信号传导并降低了IL6 mRNA水平。这些发现表明BET抑制剂使用BRD4 / IL6轴来抑制STAT3信号传导。

研究人员还评估了STAT3信号传导是否通过将对照和STAT3沉默的黑色素瘤细胞与舒尼替尼或舒尼替尼加BET抑制剂孵育来介导BET抑制剂诱导的舒尼替尼细胞敏化。BET抑制剂处理后，对照细胞具有显着程度的舒尼替尼致敏，但STAT3沉默的细胞没有。静态使黑色素瘤细胞对舒尼替尼敏感，但在BET抑制剂存在下没有进一步增强这种敏化。

当研究人员在BET抑制剂治疗和BRD4沉默后重叠下调基因时，他们发现了35个差异表达的基因。其中，GDF15和IL1A显着增加了对舒尼替尼耐药的细胞中的mRNA水平和长期舒尼替尼停药后相当的mRNA水平。GDF15表达与舒尼替尼logIC50呈正相关，但IL1A表达不呈正相关。实时聚合酶链反应（PCR）分析证实，BET抑制剂处理降低了舒尼替尼耐药细胞中的GDF15 mRNA水平并增加了GDF15表达。

此外，GDF15敲除增加了细胞对舒尼替尼的敏感性，GDF15过表达降低了这种敏感性，表明BET抑制剂通过抑制GDF15表达和STAT3活性来调节黑色素瘤细胞对舒尼替尼的敏感性。

研究人员还发现，与对照细胞相比，STAT3沉默细胞的GDF15表达降低，并且GDF15b表达在静态处理后进一步降低。ChIP-qPCR 分析证实，在黑色素瘤细胞中，STAT3 与 GDF15 启动子结合。

由于BET抑制剂比静态治疗或STAT15沉默更强烈地抑制GDF3，研究人员假设这种抑制可能以BRD4 / IL6 / STAT3轴以外的另一种方式发生。当试图确定BRD4是否可以直接调节GDF15表达时，研究人员发现用BET抑制剂处理的STAT沉默细胞确实降低了GDF15表达。

为了评估舒尼替尼加BET抑制剂在黑色素瘤中的治疗潜力，研究人员通过在裸鼠的右胁接种A375细胞来创建皮下异种移植模型。当肿瘤体积达到50至100mm 3时，将小鼠随机分配到载体，舒尼替尼，NHWD-870或舒尼替尼加NHWD-870队列中。所有治疗均连续2天进行，然后1天不治疗。

与其他组相比，组合队列中的肿瘤重量和体积减少，小鼠体重没有显着变化。治疗肿瘤的实时PCR分析显示，NHWD-15和组合队列中的GDF6和IL870 mRNA表达降低，免疫组织化学（IHC）染色显示这些队列中GDF15，p-STAT3（Y705）和p-STAT3（S727）的蛋白质水平降低。

此外，Ki67的IHC染色显示组合队列中的增殖细胞较少，并且TUNEL测定显示该队列的凋亡细胞数量增加。这些发现表明BET抑制剂和舒尼替尼在诱导体内肿瘤抑制方面的协同作用。

“这些发现有可能转化为黑色素瘤和其他疾病的新疗法，这些疾病可以用BET抑制剂和舒尼替尼联合治疗，”研究作者总结道。

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